检测人体细胞中不需要的DNA断裂的新方法

作者:伍谜川

<p>来自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9基因编辑复合物哈佛医学院的研究人员开发了一种新的方法,用于检测人类细胞的整个基因组中不需要的DNA断裂,这些DNA是由称为CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶的流行基因编辑工具诱导的</p><p>在人类细胞中首次描述这些脱靶效应的同一团队描述了他们的新平台,在Nature Biotechnology“GUIDE-seq”上发表的报告中称为GUIDE-seq(通过测序评估的全基因组无偏识别双链断裂)</p><p>是第一个全基因组灵敏检测CRISPR-Cas核酸酶诱导的脱靶DNA断裂的方法,这种方法不是假设这些脱靶位点类似于靶位点,“HMS病理学副教授J Keith Joung说</p><p>在Mass General和论文的高级作者“这种能力,以前不存在,对评估CRISPR的任何临床应用至关重要-Cas RNA-guided nucleases“用于切割DNA的双链以引入遗传变化,CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶将一种名为Cas9的细菌基因切割酶与一种与之匹配和结合的短RNA片段结合起来</p><p>靶DNA序列在2013年Nature Biotechnology论文中,Joung和他的同事报告发现CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶也可以在与靶位点有显着差异的位点诱导双链断裂,包括多达5个核苷酸的错配</p><p>这些脱靶突变可能潜在地导致不良反应,包括癌症,识别并最终减少不需要的双链断裂的能力对于这些RNA引导的核酸酶的安全临床应用至关重要,作者指出他们开发的方法涉及使用短链双链寡核苷酸,通过细胞DNA中的双链断裂吸收,作为由你引起的脱靶断裂的标记CRISPR-Cas的标签这些标签允许对那些基因组区域进行鉴定和随后的测序,精确定位脱靶突变的位置用GUIDE-seq进行的实验表明它足够灵敏,可以检测CRISPR RNA引导的核酸酶诱导的脱靶位点在细胞群中频率低至01%的基因的不需要的突变这些实验还表明,没有简单的规则可以预测脱靶双链断裂的数量或位置,因为发生了许多此类突变在与目标站点非常不同的站点上设计用于通过分析目标序列来预测脱靶变异的两个现有工具在预测已确认的脱靶站点以及未证实的错误识别站点方面远不如GUIDE-seq有效</p><p>比较GUIDE-seq用一种名为ChIP-seq的工具切割,该工具识别蛋白质与DNA链结合的位点,确认ChIP-seq没有提供了一种鉴定CRISPR-Cas诱导的双链断裂的稳健方法GUIDE-seq还能够鉴定未被诱导表达CRISPR RNA指导的核酸酶的对照细胞系中的断点热点“各种论文描述了脆弱的基因组位点在人类细胞之前,“Joung指出,”但是这种方法可能是第一个在没有添加增加这种断裂发生的药物的情况下识别这些位点我们也惊讶地发现这些断裂主要发生在两个细胞的不同部位</p><p>本研究中使用的细胞系捕获这些RNA引导的核酸酶非依赖性断裂的能力表明GUIDE-seq可能是研究和监测活细胞DNA修复的有用工具“此外,GUIDE-seq能够验证他们的方法通过缩短引导RNA片段来提高CRISPR-Cas的准确性减少了整个基因组中双链断裂的数量Joung还期望GUIDE-seq将是有用的鉴定其他基因编辑工具诱导的脱靶休息随着追求这种可能性,Joung指出了调查人类细胞中脱靶突变的发生率和检测的重要性,这些突变未被改变以产生细胞系 - 这一过程将它们转化为永生化癌细胞了解未转化细胞中脱靶突变的范围和数量将更好地了解CRISPR-Cas RNA引导的核酸酶和其他工具如何在临床应用中发挥作用 “GUIDE-seq方法执行起来非常简单,我们打算在不久的将来在wwwjounglaborg / guideseq上为非商业研究人员提供在线分析测序数据的软件,”Joung Jung的专利申请包括GUIDE-seq技术已提交支持该研究包括美国国立卫生研究院(NIH)主任的先锋奖DP1 GM105378; NIH授予R01 GM088040,R01 AR063070和F32 GM105189; Jim和Ann Orr马萨诸塞州综合医院研究学者奖;和国防高级研究计划局授予W911NF-11-2-0056出版物:Shengdar Q Tsai等,“GUIDE-seq能够通过CRISPR-Cas核酸酶实现脱靶切割的全基因组分析”,Nature Biotechnology(2014); doi:101038 / nbt3117消息来源:哈佛医学院的Sue McGreevey图片:....